חוקרים מדמיינים פעילות של מספריים גנטיות של CRISPR: שיטה חדשה מאפשרת תצפית מדויקת על זיהוי גנים

פרסומת
X-ray_Promo1


כאשר חיידקים מותקפים על ידי וירוס, הם יכולים להגן על עצמם באמצעות מנגנון שמדוף את החומר הגנטי שמכניס הפולש. המפתח הוא מתחמי חלבון CRISPR-Cas. רק בעשור האחרון התגלה והובהר תפקידם לחסינות אדפטיבית במיקרואורגניזמים. בעזרת RNA מוטבע, הקומפלקסים של CRISPR מזהים רצף קצר ב-DNA של התוקף. מנגנון זיהוי הרצף על ידי RNA שימש מאז לכיבוי ושינוי סלקטיבי של גנים בכל אורגניזם. גילוי זה חולל מהפכה בהנדסה הגנטית וכבר בשנת 2020 זכה בפרס נובל בכימיה לעמנואל שרפנטייה וג'ניפר א. דודנה.

פרסומת

עם זאת, מדי פעם, מתחמי CRISPR מגיבים גם למקטעי גנים השונים מעט מהרצף שצוין על ידי ה-RNA. זה מוביל לתופעות לוואי לא רצויות ביישומים רפואיים. "הגורמים לכך עדיין לא מובנים היטב, מכיוון שלא ניתן היה לצפות בתהליך ישירות עד עכשיו", אומר דומיניק קאוארט, שעבד על הפרויקט כסטודנט לדוקטורט.

מעקב אחר תהליכים בקנה מידה ננומטרי

כדי להבין טוב יותר את תהליך הזיהוי, הצוות בראשות פרופסור ראלף זיידל ודומיניק קאוארט ניצל את העובדה שהסליל הכפול של ה-DNA של רצף המטרה מתפרק במהלך הזיהוי כדי לאפשר זיווג בסיסים עם ה-RNA. "השאלה המרכזית של הפרויקט הייתה אם כן האם ניתן בכלל לעקוב בזמן אמת אחר התפרקות פיסת DNA שאורכה רק 10 ננומטר (ננומטר) בזמן אמת", אומר קאוארט.

כדי לבחון את תהליך ההתפרקות בפירוט, המדענים היו צריכים להפוך אותו לגלוי למיקרוסקופ. כדי להשיג מטרה זו, הצוות התבסס על הישגי ננו-טכנולוגיית ה-DNA, שניתן להשתמש בה כדי ליצור כל ננו-מבנה תלת-ממדי של DNA. תוך שימוש בטכניקת אוריגמי ה-DNA הזו, החוקרים בנו זרוע רוטור DNA באורך 75 ננומטר עם ננו-חלקיק זהב מחובר לקצה שלה. בניסוי, השחרור של רצף ה-DNA הדק ב-2 ננומטר ובאורך 10 ננומטר הועבר לסיבוב של ננו-חלקיק הזהב לאורך מעגל בקוטר של 160 ננומטר – ניתן להגדיל את התנועה הזו ולעקוב אחריה באמצעות מערך מיקרוסקופ מיוחד.

בשיטה חדשה זו, החוקרים הצליחו לצפות בזיהוי הרצף על ידי קומפלקס CRISPR Cascade כמעט זוג בסיסים אחר זוג בסיסים. באופן מפתיע, זיווג בסיסים עם ה-RNA אינו מועיל מבחינה אנרגטית, כלומר הקומפלקס נקשר רק בחוסר יציבות במהלך זיהוי רצף. רק כאשר כל הרצף מזוהה מתרחשת קישור יציב וה-DNA מושמד לאחר מכן. אם זה רצף מטרה "שגוי", התהליך מופסק.

הממצאים יסייעו בבחירת רצפי RNA מתאימים

העובדה שתהליך הזיהוי מייצר לפעמים תוצאות שגויות נובעת מאופיו הסטוכסטי, כלומר מתנועות מולקולריות אקראיות, כפי שהצליחו כעת החוקרים להוכיח. "זיהוי רצפים מונע על ידי תנודות תרמיות בשיוך הבסיסים", אומר קאוארט. בעזרת הנתונים שהתקבלו, ניתן היה ליצור מודל תרמודינמי של זיהוי רצף המתאר זיהוי של מקטעי רצף סוטים. בעתיד, זה אמור לאפשר בחירה טובה יותר של רצפי RNA המזהים רק את רצף היעד הרצוי, ובכך לייעל את הדיוק של מניפולציה גנטית.

מכיוון שהננו-רוטורים המעוצבים הם אוניברסליים בהתאמתם למדידת פיתולים ומומנטים במולקולות בודדות, ניתן להשתמש בהם גם עבור קומפלקסים אחרים של CRISPR-Cas או ביומולקולות.

העבודה מומנה על ידי מועצת המחקר האירופית וקרן המחקר הגרמנית ובוצעה בשיתוף עם קבוצת המחקר של פרופסור וירג'יניוס סיקסניס מאוניברסיטת וילנה בליטא, אשר בודדה וסיפקה את מתחמי ה-CRISPR בהם נעשה שימוש.



קישור לכתבת המקור – 2023-07-12 19:47:35

Facebook
Twitter
LinkedIn
Telegram
WhatsApp
Email
פרסומת
X-ray_Promo1

עוד מתחומי האתר